自从1985年美国科学家Kary Mullis发明PCR方法以来，该方法已经成为生命科学研究领域中最常规的实验方法之一。PCR方法就是在体外采用酶促反应来特异性合成特定核酸片段达到富集的目的，PCR扩增产物可用于下游多种应用，如克隆表达、芯片杂交、突变检测、测序等等。

最传统的"第一代PCR"采用琼脂糖电泳的方式对PCR产物进行分析，但存在着操作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风险大等不足。为了避免上述传统PCR的缺陷，并对基因的表达水平进行定量分析，1992年诞生了所谓"第二代PCR"的荧光定量实时PCR。

定量PCR(quantification PCR)在PCR扩增的同时对反应体系中的荧光信号进行实时收集，通过三个参数间（荧光信号-Cq值-靶基因的起始浓度）的关系，最终确定靶基因的拷贝数或基因的表达水平。由于定量PCR的分析最终结果依赖于Cq值，2009年The MIQE Guides(Clinical Chemistry 55 :4 611-622)的发表明确了定量实验整个流程标准化的重要性，否则就会出现实验结果无法重复，甚至结果互相矛盾的状况。更重要的该文献还给出了如何规范定量PCR流程的checklist，其核心目的就是在规范的实验流程、统一的设计思路下，得到的结果才具有可重复性，也具有可比性。但依赖于Cq值仍然是目前定量PCR最大的技术瓶颈，在这个意义上所谓的"定量"也只是相对的。而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件下，其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。在这种背景下，"第三代PCR"应运而生。

Bio-Rad公司的QX100微滴式数字PCR系统就属于"第三代PCR"技术。QX100微滴发生器（droplet generator）将含有核酸分子的反应体系形成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子，且每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。经PCR扩增后，采用微滴阅读仪（droplet reader）逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0（因此该技术被称为"数字PCR"），最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。

微滴化处理步骤是QX100微滴式数字PCR的关键，使得每个微小的反应体系内进行单分子或几个分子的扩增，从而在如下方面的应用中具有突出的优势：

靶分子具有细微差异条件下的分析，如拷贝数变异。
在野生型序列构成的遗传背景中检测低频率的突变序列，灵敏度可达0.001%。

可实现无需标准品的绝对定量。

转自——生物谷